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多孔钛合金协同全身振动及脉冲电磁场刺激对骨

作者:888扑克手机版 发布时间:2020-07-22 12:21 点击数:

  通过动物实验和细胞实验研究高频低强度全身振动刺激(WBV)和脉冲电磁场(PEMF)协同多孔钛合金(pTi)对骨缺损的修复效果并探索机制。使用新西兰白兔制作骨缺损模型,植入pTi。将动物按体重随机分为WBV组、PEMF组和Control组。实验组分别每天施加30Hz、0.3g全身振动刺激1h、15Hz、20G脉冲电磁场刺激2h,对照组不做任何处理。6周、12周后分别取材,通过Micro-CT、荧光双标、masson染色、qRT-PCR方法评估骨缺损的修复效果。将3~5代兔成骨细胞按照5*104/ml密度种植于pTi表面,实验组每天施加与体内实验相同时间和参数的物理刺激,对照组不做任何处理。3天后,通过MTT法、荧光染色、电镜、qRT-PCR、western-blot技术检测细胞在钛合金表面的增殖、粘附、细胞形态、成骨相关的基因和蛋白表达。

  大量的在体实验研究证实,高频、低强度的全身振动刺激(WBV)能够显著抑制去势、废用以及肥胖诱发的骨质疏松,表现出很强的促进骨合成代谢的作用以及一定程度的抗骨吸收效果。脉冲电磁场(PEMF)在治疗骨折、骨质疏松、骨不连方面有大量的文献报道。以上两种物理刺激都具有经济、无创、副作用小的优点,具有广阔的临床应用前景。而多孔钛合金(pTi)以其优良的生物相容性、抗腐蚀性、低弹性模量已经成为一种非常有前途的治疗骨缺损的移植替代物,并在临床上得到了广泛的应用,但多孔钛合金作为一种生物惰性材料,其与骨组织在微观层面很难实现完全整合,尤其在多孔钛合金内部,骨小梁的长入十分缓慢,与钛合金的整合效果也较差,这就容易造成植入体的松动和脱落。

  为了提高pTi对骨缺损的修复效果,我们分别将WBV、PEMF两种刺激作用于植入pTi的兔骨缺损动物模型中,选用新西兰大耳白兔,雌性,体重2.70.5kg,在兔股骨外侧髁制作6mm宽*8mm长得圆柱形骨缺损填充怕pTi。实验动物按体重随机分为WBV组、PEMF组、Control组。通过查阅文献,我们确定了WBV的参数为频率30Hz、加速度0.3g,作用时间1h/d,PEMF的参数为频率15Hz、20G,作用时间2h/d。经过6周、12周的修复,对实验动物取材,通过Micro-CT、荧光双标、masson染色、 qRT-PCR观察骨缺损的修复效果。Micro-CT检查发现WBV、PEMF刺激均能促进骨组织与pTi的结合和在其内部的长入,masson染色进一步验证了这一点。骨形态参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著高于对照组(P0.01),BS/BV和Tb.Sp低于对照组(P0.01)。荧光双标分析表明WBV组与PEMF组矿化沉积率和骨生成速度显著高于Control组(P0.01)。qRt-PCR检查结果显示WBV和PEMF均能显著提高动物骨组织中ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG、Wnt3、-catenin、LRP 6基因表达。

  为了探究WBV及PEMF协同pTi对骨缺损的修复机制,我们将兔原代成骨细胞(3~5代)种植于pTi表面,分为WBV组、PEMF组和Control组,实验组进行相应的物理刺激,参数与动物实验保持一致,实验周期为3d。通过MTT法检测细胞增殖,免疫荧光染色和电镜检测细胞形态及黏附。提取总DNA进行qRT-PCR检测成骨基因及经典Wnt信号通路基因表达。提取总蛋白进行Western blot检测OCN、RunX2和经典Wnt信号通路蛋白表达。结果发现两种物理刺激均能促进成骨细胞在pTi表面的增殖、分化和粘附。细胞骨架染色发现实验组细胞的微丝排列更加规律,且微丝数量更多。qRT-PCR和Western-blot检测发现两种物理刺激均能上调pTi中细胞的成骨基因ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG及经典Wnt信号通路基因表达(P0.01),并促进Wnt3、-catenin、LRP6、Runx2、OCN的蛋白表达(P0.01)。

  通过我们的动物实验发现,WBV和PEMF均能促进骨小梁在钛合金表面的结合和在多孔材料内部的长入,加快骨缺损的愈合,从而提高了种植体在骨组织中的稳定性,减少了松动的风险。离体实验发现WBV和PEMF均能促进成骨细胞在pTi表面的增殖和粘附,增加成骨细胞的微丝并使其排列更加规律。在基因层面,在体实验发现两种物理刺激均能上调兔股骨中ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG和Wnt信号通路基因表达。离体实验中,两种物理刺激使种植在pTi表面的成骨细胞中ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG及经典Wnt信号通路基因都呈现了高表达,并提高了细胞中Wnt3、-catenin、LRP6、Runx2、OCN的蛋白表达。

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